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免疫荧光法的注意事项

发布时间:2020/3/11 点击量:665

免疫荧光法的注意事项

    免疫荧光技术又称荧光抗体技术,是标记免疫技术中发展zui早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
    免疫荧光技术按原理可分为直接法和间接法。所谓直接法就是将标记的特异性荧光抗体,直接加在抗原标本上,经过一定的温度和时间的染色,用水洗去未参加反应的多余荧光抗体,室温下干燥后封片、镜检。
    那么在进行直接免疫荧光法的操作时,有哪些是需要我们注意的呢?
    1.对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响观察的结果;
    2.染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原的变化,染色时间可以从10min到数小时,一般30min已足够。染色温度多采用室温(25°C左右),高于37°C可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2°C的低温,延长染色时间。低温染色过夜较37°C30min效果好的多;
    3.为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。
    1)标本自发荧光对照:标本加1-2滴0.01mol/L,pH7.4的PBS;
    2)特异性对照(抑制试验):标本加未标记的特异性抗体,再加荧光标记的特异性抗体;
    3)阳性对照:已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。
    如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光,阳性对照和待检标本呈强荧光,则为特异性阳性染色。
    4.一般标本在高压汞灯下照射超过3min,就有荧光减弱现象,经荧光染色的标本zui好在当天观察,随着时间的延长,荧光强度会逐渐下降。
    间接法就是在检查位置抗原时,先用已知未标记的特异抗体(di一抗体)与抗原标本进行反应,用水洗去未反应的抗体,再用标记的抗体(第二抗体)与抗原标本反应,使之形成抗原-抗体-抗体复合物,再用水洗去未反应的标记抗体,干燥、封片后镜检。如果检查位置抗体,则表明抗原标本是已知的,待检血清为di一抗体,其他步骤的抗原检查相同。
    标记的抗体是抗球蛋白抗体,同于血清球蛋白有种的特异性,如免疫抗鸡血球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应,因此,制备标记抗体适用于鸡任何抗原的诊断。
    操作间接免疫荧光法时我们应注意以下几点:
    1.荧光染色后一般在1h内完成观察,或于4°C保存4h,时间过长,会使荧光减弱;
    2.每次试验时,需设置以下三种对照:
    1)阳性对照:阳性血清+荧光标记物
    2)阴性对照:阴性血清+荧光标记物
    3)荧光标记物对照:PBS+荧光标记物
    3.已知抗原标本片需在操作的各个步骤中,始终保持湿润,避免干燥;
    4.所滴加的待检抗体标本或荧光标记物,应始终保持在已知抗原标本片上,避免因放置不平使液体流失,从而造成非特异性荧光染色。

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